引 言

过去，我们对cfDNA的挖掘，往往局限于寻找序列上的碱基突变。然而随着研究的深入，科学家们发现，cfDNA并非只是毫无规律的核酸碎片。当它从凋亡或坏死的细胞中脱落、进入血液的那一刻起，就已经将来源细胞的组织类型、染色质状态和调控历史，完整地刻印在自身的物理形态与化学修饰中。

cfDNA所包含的分子信息可以从四个层面进行解析：

1. 片段组学层面：DNA是怎样被切割的？

片段组学是与基因组学、表观基因组学并列的独立研究维度，通过片段长度、片段分布、末端基序、断点基序、拷贝数改变等特征，研究cfDNA的形成方式、组织来源及疾病变化。

2. DNA甲基化层面：哪些基因组区域发生了表观遗传变化？

DNA甲基化修饰在基因表达调控、基因组稳定性维持中发挥核心作用。cfDNA中的甲基化模式可反映来源细胞的表观遗传状态，已成为癌症早筛、微小残留病灶（MRD）监测、器官移植排斥评估等场景的重要生物标志物。

3. 组蛋白修饰层面：哪些染色质区域处于活跃或抑制状态？

血浆中的cfDNA保留了核小体上的组蛋白修饰特征，通过针对特定组蛋白修饰的抗体进行免疫沉淀富集，可在全基因组范围内解析相应修饰的分布图谱，进而间接反映组织来源、基因表达调控状态及疾病相关染色质异常。

4. DNA拓扑层面：是否存在特殊的环状DNA？

eccDNA游离于染色体基因组之外，具有不同于线性cfDNA的结构特征。对其进行鉴定、定量和甲基化分析，可拓展液体活检分子标志物的研究范围。

图1：血液中包含的多层生物信息

一、为什么cfDNA研究正在走向多维整合？

首先，肿瘤来源cfDNA在早期和低肿瘤负荷样本中通常含量较低，单纯依赖少数突变位点，可能受到肿瘤异质性、克隆性造血和检测覆盖范围等因素影响。

其次，突变、片段化、DNA甲基化和组蛋白修饰反映的是cfDNA不同层面的生物学信息，单一维度难以同时覆盖序列变化、组织来源和染色质状态。

更重要的是，cfDNA本身就是一个多层次的信息载体。它不仅携带来源细胞的基因序列，还保留了片段长度、断裂末端及表观遗传修饰等特征。对这些互补信号进行联合分析，有望扩大可利用的特征空间，提升液体活检研究对低丰度信号、复杂肿瘤异质性和组织来源差异的解析能力。

液体活检正在完成从“单标志物”到“多模态整合”的范式转变。2025年《基于液体活检技术的多癌种联合筛查专家共识》明确指出，甲基化联合片段组学等多维特征，具有进一步提升多癌种联合筛查研究性能的潜力。这也意味着，多维信号的联合分析能突破单一标志物的瓶颈，更敏锐地捕捉疾病踪迹、更精准地溯源病灶组织。

这些cfDNA的分子特征无一不在诉说着肿瘤及其他疾病发生的隐秘信号。然而如何从一管有限的血液样本中，高效、完整地提取这些分子标志物，并进行多维度数据整合？云序生物为您提供一套系统化的解决方案，为液体活检相关的标志物发现、组织来源研究、疾病动态监测及机制探索提供支持。

二、云序生物cfDNA产品体系

图2：云序生物cfDNA液体活检四维产品矩阵

云序生物不仅提供单一技术，更提供可灵活组合的四维产品矩阵，覆盖从经典到前沿的所有主流液体活检维度。

维度一：cfDNA片段组学——不依赖突变，兼具物理结构特征与基因组变异信号

【适用场景】

无需先验突变信息的多癌种早期筛查、肿瘤组织来源溯源、治疗响应与MRD动态监测、样本量有限的回顾性队列研究。

【产品检测目标】

解析cfDNA天然的物理结构特征（片段长度、末端碱基、断点模式），并同步评估全基因组拷贝数改变（CNA）与ctDNA肿瘤分数。

【产品核心内容】

a. 片段长度分布： 分析 FSR（片段大小比）与 FSD（片段大小分布），量化不同样本长短片段的富集程度差异。

b. 末端碱基模式： 分析 EDM（末端基序）与 BPM（断点基序），捕捉核酸酶切割在不同组织来源中的特异性偏好。

c. 拷贝数改变与肿瘤分数： 提供全基因组拷贝数改变（CNA）分析及 ctDNA 肿瘤分数估算，涵盖基因组学的核心变异信息。

【产品优势】

低起始量：提取纯化后5 ng cfDNA 即可稳定建库，对珍贵样本极友好。

一库多得：单次低深度 WGS 即可同步获得片段长度、末端碱基、断点模式以及 CNA和 ctDNA 肿瘤分数，兼顾结构表观特征与基因组变异。

无损保留：无需抗体富集与碱基化学转化，最大程度保留 cfDNA 天然原始的物理特征与序列信息。

维度二：cfDNA 甲基化——从区域筛选到单碱基精确定位，兼顾片段组学

【适用场景】

肿瘤早筛与辅助诊断、肿瘤组织溯源、表观遗传调控机制研究，以及希望同时获取“甲基化+片段组学”双重信息的珍贵样本队列研究。

【产品检测目标】

解析全基因组范围内的DNA 甲基化富集区域、单碱基分辨率的甲基化绝对定量，以及带有甲基化标记的 cfDNA 片段物理特征。

【产品核心内容】

根据不同科研需求，提供针对性产品矩阵：

重点推荐：cfMethFrag-Seq——为cfDNA液体活检量身打造的双组学方案

传统方案若同时做甲基化和片段组学，通常要拆分样本分别建库。WGBS 的亚硫酸氢盐处理会严重降解 DNA；EM-Seq 虽较温和，但碱基转化仍会改写原始序列，末端基序等片段特征难以可靠保留。

cfMethFrag-Seq正是针对上述痛点设计的，一份 cfDNA 并行构建两个文库：

✅️ IP 文库：甲基化抗体富集，做全基因组甲基化区域分析

✅️ 同源 Input 文库：不经富集、不经碱基转化，既作背景对照，也完整保留片段组学信息

由此一次取样同时获得：甲基化修饰数据和片段组学数据，还可单独分析“被甲基化抗体拉下来的片段”本身的长度与末端特征。

图3：cfMethFrag-Seq流程图

cfMethFrag-Seq 优势：

同一样本、两类数据： 不拆批次、不二次采血，甲基化与片段组学天然配对。

消除批次与个体差异： 同一样本并行建库，消除采血批次影响；自带同源 Input 作为个体背景基线，结果可比性更强。

真实保留物理特征： Input 文库未经化学或酶法转化，完整保留 cfDNA 原始片段长度和末端基序。

多维关联分析： 支持单独提取并解析“被甲基化抗体富集到的片段”所具备的独特长度与末端特征。

维度三：cfDNA组蛋白修饰——直接读取来源细胞的基因“开关状态”

【适用场景】

肿瘤分子亚型分型、无创推断细胞转录活性、耐药机制中的染色质重塑研究、特定基因调控区动态监测。

【产品检测目标】

检测体液中细胞游离核小体上特定组蛋白修饰（如H3K4me3/H3K27ac/H3K36me3等）及其结合的 cfDNA 序列与片段特征。

【产品核心内容】

重点推荐：cfChIPFrag-seq——一份血浆，同时回答"哪些基因被标记"与"片段有何结构特征"

传统cfChIP-seq仅能识别哪些区域带有特定组蛋白修饰，但无法同时解析cfDNA的物理结构特征。

图4：cfChIPFrag-Seq流程图

cfChIPFrag-seq通过并行构建ChIP文库与同源Input文库：

✅ 直接读取基因活性： ChIP文库直接反映cfDNA释放细胞的染色质开闭状态与基因转录活性。

✅ 保留完整片段信息： Input文库未经抗体富集或化学处理，完整保留cfDNA原始片段长度、末端基序及CNA信息。

✅ 挖掘联合特征： 可研究"携带特定组蛋白修饰的cfDNA片段"与"整体cfDNA片段"在长度、末端模式上的差异，揭示表观修饰与片段化之间的关联。

✅ 精准建库： 采用单链DNA（ssDNA）建库技术，高效捕获超短、受损及极低丰度的cfDNA，降低损失。

维度四：体液eccDNA——探索染色体外环状DNA新世界

【适用场景】

新型液体活检标志物发现、肿瘤异质性与演化研究、eccDNA 驱动基因扩增与耐药机制探索。

【产品检测目标】

血浆中游离于染色体基因组之外的环状DNA（eccDNA）的拓扑结构、环状节点、基因组来源、丰度分布及其 DNA 甲基化表观修饰。

【产品核心内容】

a. 体液 eccDNA-seq： 经过核酸外切酶消化线性 DNA，配合 Tn5 转座酶开环建库，实现体液 eccDNA 的鉴定、丰度定量、环状连接位点识别及基因注释。

b. 体液 eccDNA 甲基化测序： 在 eccDNA-seq 流程中引入温和酶法转化，一次性获取环状拓扑结构信息与单碱基甲基化修饰信息。

图5：体液eccDNA甲基化测序流程图

【产品优势】

高效去线性化： 专为体液优化的外切酶消化体系，彻底清除大量线性cfDNA 背景干扰，提升环状 DNA 检出率。

Tn5转座酶一步法： 采用高活性Tn5转座酶完成开环与加接头，建库高效且无切割偏好性。

结构与表观一次获得： 体液 eccDNA 甲基化测序可在鉴定、定量之外，同步给出环状 DNA 上的单碱基甲基化信息。

三、样本采集与保存建议

（1）样本量

推荐血浆≥5 mL

根据样本类型、目标修饰、cfDNA产量和研究方案综合评估，其他体液类型或者样本量不足时请电询。

（2）样本采集：

建议使用 EDTA 抗凝采血管（紫帽管）或专用 Cell-free DNA Stabilization Tube（如 Streck 管）采集全血，不推荐使用肝素抗凝管（绿帽管）。采血后应尽快离心分离血浆（或按 Streck 管推荐条件处理）。

（3）样本运输：

将分离后的血浆分装至无 RNA/DNA 酶污染的冻存管中，密封（可使用封口膜），全程干冰运输。

（4）样本保存：

血浆建议分装保存，避免反复冻融，保存于-80 ℃冰箱。

四、从单一信号到多维协同，重塑cfDNA分子标志物研究价值

液体活检正在从依赖单一分子标志物，迈向多维信号协同解析。突变、片段化、甲基化、组蛋白修饰和环状DNA分别对应不同层面的生物学信息，各有优势，也各有盲区。单一维度适合回答明确、聚焦的问题；多维整合则更适合低丰度、强异质性和组织来源复杂的研究场景。

图6：云序生物cfDNA液体活检全产品列表

云序生物已建立可独立选择的技术路线：cfDNA片段组学分析、cfDNA MeDIP-Seq、cfDNA EM-Seq、超微量cfChIP-Seq、eccDNA-Seq及eccDNA甲基化测序。研究者可按科学问题、样本条件和预算，直接选择最匹配的单一维度方案。

在此基础上，云序生物进一步推出多组学联合分析新品cfMethFrag-Seq与cfChIPFrag-Seq，通过同源Input，将甲基化或组蛋白修饰与片段组学放在同一次取样中联合解析，减少批次与个体差异。在液体活检这种低丰度、强异质性场景中，增加互补维度往往比单纯加深单一维度的测序深度更有价值。

多维研究也不局限于固定组合。云序生物可根据研究目标、样本量和数据需求，灵活组合上述产品，并提供相应的联合分析与定制化支持。我们的目标不是简单叠加检测项目，而是围绕同一个科学问题，选出真正具有互补价值的信号。

从单一信号到多维协同，从独立检测到同源联合分析。欢迎联系云序生物，定制适合您项目的cfDNA研究方案。

云序生物介绍

上海云序生物科技有限公司（简称“云序生物”）成立于2015年，坐落于上海漕河泾新兴技术开发区，是国家高新技术企业及ISO9001认证单位。公司以RNA修饰组、表观遗传学与新型时空组学为特色，依托高通量测序、质谱技术、生物信息学等平台，致力于为全球科研与临床用户提供专业、精准、系统性的组学解决方案。云序生物以“技术创新+全链条服务”为核心，通过专利技术应用（如GLORI）、临床微量样本技术优化及单细胞-空间多组学整合能力，持续推动表观遗传与转录组学发展，赋能基础科研与精准医疗。

核心优势与创新技术

一、专利技术与特色平台

1. RNA修饰测序技术

专利授权GLORI技术：获北京大学《Nature Biotechnology》发表的单碱基分辨率m6A测序金标准专利授权，实现RNA甲基化图谱的精准解析。

全面单碱基修饰检测：提供m6A、ac4C、m5C、m7G、m1A、O8G等全类别RNA修饰单碱基测序服务，覆盖修饰研究全维度需求。

2. 环状DNA研究全链条服务

核心资源：独家代理国际知名品牌A&A Bio的环状DNA富集纯化柱，实现环状DNA的高效富集，为环状DNA测序保驾护航。

系统性服务：全面提供Circle-Seq、体液eccDNA测序、体液eccDNA甲基化测序等特色服务。

3. 临床微量样本解决方案

针对血浆、FFPE、微量细胞等珍贵样本，推出高灵敏度表观组与转录组技术，如cfMeDIP-Seq，cfDNA EM-Seq，超微量MeRIP-Seq，绝对定量cfRNA测序等。

4. 表观遗传组综合研究平台

覆盖DNA/RNA互作、染色质开放性、组蛋白修饰全维度，如：

R-loop研究（ssDRIP-Seq、DRIPc-Seq、R-loop CUT&Tag）

蛋白-RNA互作（RIP-Seq、RNA Pull-down-MS）

染色质可及性（ATAC-Seq）

组蛋白修饰 （CUT&Tag、ChIP-Seq）

DNA修饰（MeDIP-Seq、hMeDIP-Seq和EM-Seq）

5. 前沿时空组学技术

提供各类前沿单细胞多组学与空间原位分析技术，如单细胞转录组测序、单细胞ATAC测序、单细胞ChIP/CUT&Tag测序、空间转录组以及下游验证服务多重免疫组化（mIHC）等。