【使用方法】

（一）染色前准备

储存液配制

溶剂选择：EthD-1需溶于DMSO或甲醇，避光分装后于-20℃或-80℃长期保存，避免反复冻融8。

注意事项：DMSO需新鲜使用，避免吸湿影响溶解度；储存液建议分装，避免污染。

工作液配制

常规细胞染色：推荐浓度1-5 μM。

高背景干扰时：可降低浓度至0.1-1 μM。

稀释方法：使用无血清细胞培养基或PBS将储存液稀释至终浓度0.1-10 μM，具体浓度需根据细胞类型和实验需求调整。

例如&现用现配：工作液需当天使用，避免荧光淬灭。

（二）细胞染色步骤

适用场景：检测死细胞。

操作流程：

（1）细胞准备

悬浮细胞：离心收集，用PBS洗涤2次，去除培养基残留。

贴壁细胞：弃去培养基，用胰酶消化成单细胞悬液，离心洗涤后重悬于PBS。

注意：若需固定细胞，需在染色前固定，但固定后EthD-1可能无法保留，建议优先活细胞染色。

（2）染色孵育

加入EthD-1工作液，室温避光孵育15-60分钟。

优化时间：孵育时间过长可能导致非特异性结合，建议通过预实验确定合适时间。

（3）洗涤与重悬

离心去除染色液，用PBS洗涤2次，弃上清后用无血清培养基或PBS重悬细胞。

（4）检测

荧光显微镜：选择红色荧光通道，观察死细胞核的红色荧光。

流式细胞仪：设置红色荧光检测通道，分析死细胞比例。若需区分活细胞，可联合钙黄绿素AM进行双染。

酶标仪：用于高通量检测，需使用黑色酶标板，检测荧光强度。

（三）与其他染料联用

EthD-1常与活细胞染料联用，以同时评估细胞活力：

钙黄绿素AM（Calcein AM）：活细胞酯酶将其水解为绿色荧光化合物，与EthD-1的红色荧光互补，可清晰区分活细胞（绿）与死细胞（红）。

碘化丙啶（PI）：与EthD-1类似，但EthD-1对DNA亲和力更高，荧光更稳定，适用于复杂样本。

【技术参数】

英文名称：Ethidium Homodimer 1 (EthD-1)

中文名称：溴乙啡锭二聚体1

CAS NO：61926-22-5

分子式：C46H50Cl4N8

分子量：856.75

状态：红色固体

Ex/Em：528/617nm

溶解性：溶于DMSO（2mM）、甲醇

纯度：≥95%

储存条件：-20℃避光干燥

【描述与基本特性】

EthD-1是一种由两个乙锭分子通过乙二胺连接形成的同型二聚体化合物，EthD-1具有强正电荷特性，无法穿透完整细胞膜，但可与双链DNA（dsDNA）、单链DNA（ssDNA）、RNA及寡核苷酸结合，结合后荧光强度增强超过30倍。

作用机制

EthD-1的作用机制主要基于其与核酸的相互作用及电荷依赖的细胞选择性，具体可分为以下方面：

（一）核酸结合与荧光增强

嵌入式结合：EthD-1通过插入DNA双螺旋结构的碱基对之间，每个分子覆盖约4个碱基对，形成稳定的复合物。

这种结合方式导致其荧光强度显著增强，适用于高灵敏度的核酸检测。

多序列兼容性：与EB、PI等染料类似，EthD-1对核酸的结合无明显序列特异性，但对双链DNA的亲和力显著高于单链DNA或RNA。

（二）电荷依赖的细胞选择性

活细胞排斥：EthD-1携带强正电荷，而活细胞膜的磷脂双层具有负电荷屏障，因此无法穿透完整细胞膜。

死细胞渗透：当细胞膜因死亡或损伤失去完整性时，EthD-1可穿过无序的膜区域进入细胞核，与核酸结合后发出红色荧光，从而标记死细胞。

（三）细胞活力检测

EthD-1常与钙黄绿素AM联用，形成活/死双染体系：

活细胞标记：钙黄绿素AM在活细胞内酯酶作用下脱去乙酰基，转化为绿色荧光物质，标记活细胞。

死细胞标记：EthD-1仅标记膜通透性增加的死细胞，发出红色荧光。通过荧光显微镜或流式细胞仪可同时观察活/死细胞，定量分析细胞活力。

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注意：本试剂用于科研领域，其他用途概不适用！

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